| Аннотация |
Многие агонисты регулируют клеточные функции, стимулируя поверхностные рецепторы сопряженные фосфоинозитидным каскадом с мобилизацией внутриклеточного Са 2+. В невозбудимых клетках генерация внутриклеточных Са 2+ сигналов протекает преимущественно за счет выброса Са 2+ из Са 2+ -депо, локализованного в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). В этой системе IP3 -рецепторы, являющиеся внутриклеточным IP3 -активируемыми Са 2+ -каналами, обеспечивают регулируемый выброс депонированного Са 2+ в ответ на стимуляцию клеток. Ряд факторов затрудняет анализ специфической роли IP3 -рецепторов в физиологии клетки и их регуляторных механизмов. Во-первых, три гена кодируют IP3 -рецепторы, и в клетках обычно экспрессированы два из них или даже все гены. При этом разные изоформы IP3 -рецепторов находятся под контролем различных механизмов. Кроме того, изоформоспецифичные антагонисты IP3 -рецепторов не идентифицированы на данный момент. Клеточные линии, экспрессирующие IP3 -рецепторы только одного типа, представляют собой эффективную клеточную модель для исследования регуляторных механизмов, фармакологии и физиологической роли изоформ IP3 -рецепторов. В данной работе мы использовали CRISPR/Cas9 технологию для инактивации генов IP3 -рецепторов в клетках HEK-293, экспрессирующих все три гена этих белков. Были получены моноклоны генетически модифицированых клеток HEK-293 и идентифицированы те из них, которые содержали биаллельные инактивирующие мутации в двух из трех генов IP3 -рецепторов. В результате были получены моноклональные клеточные линии с единственной функциональной изоформой IP3 -рецептора, которые можно использовать для исследования роли данного подтипа IP3 -рецептора в агонист-индуцированной Са 2+ -сигнализации и анализа его регуляторных механизмов |